Спикеры

Целью работы является совершенствование ДНК-диагностики наследственных и врождённых онкологических заболеваний. Для этого разработаны и внедрены протоколы комплексной ДНК-диагностики наследственных и врождённых онкологических заболеваний на основе NGS с использованием, при необходимости, дополнительных методов ДНК-диагностики. Формирование библиотек фрагментов генома, содержащих кодирующие последовательности генов и прилежащие интронные участки, проводили с использованием технологии AmpliSeq по протоколам и на приборах Thermo Fisher Scientific. Секвенирование проводили на приборах Ion Torrent PGM и Ion S5 (Thermo Fisher Scientific) по протоколам производителя. Внедрение панелей NGS в практику поиска мутаций в генах наследственных и врождённых форм онкологических заболеваний значительно сократило сроки и повысило качество выполнения ДНК-диагностики. Средний срок проведения анализа сокращен до 1 месяца. Повышение качества ДНК-диагностики достигается, в частности, высокой чувствительностью NGS в отношении минорных мутантных клонов и эффективной фильтрацией последовательностей псевдогенов на этапе выравнивания прочитанных последовательностей на полный референсный геном.

Умственная отсталость встречается по разным оценкам у 1-3% населения. Клинически принято классифицировать умственную отсталость по тяжести, однако нозологическая классификация до сих пор остается нерешенной задачей. До 50% случаев умственной отсталости являются результатом генетических нарушений на хромосомном или генном уровне. Встречаются все возможные варианты генетических нарушений – хромосомные, аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные, Х-сцепленные и многофакторные. Для многих из них описана специфическая клиническая картина, что позволяет врачам назначать прицельные исследования кариотипа или отдельных генов. Однако для большинства форм так называемой изолированной недифференцированной умственной отсталости клинически невозможно заподозрить конкретную генетическую причину, т.к. у пациента отмечаются минимальные и неспецифические изменения фенотипа. В такой ситуации необходимо проводить полноэкзомный анализ, т.к. число уже известных генов, мутации в которых приводят к умственной отсталости, превышает 1500, и по всей видимости ещё несколько сотен генов могут пополнить этот список в будущем. По данным нескольких крупных исследований умственной отсталости с использованием полнокэзомного и полногеномного секвенирования диагностическая ценность NGS различается в зависимости от подходов к формированию выборок пациентов и колеблется от 16% при экзомном анализе до 62% при геномном анализе. Но не только клинические аспекты влияют на эффективность NGS анализа, но и технические особенности используемой платформы. Что общего и чем отличаются наиболее распространённые готовые решения для таргетного высокопроизводительного секвенирования? Эти и другие молекулярно-генетические и клинические аспекты NGS диагностики умственной отсталости будут рассмотрены в докладе.

Методы NGS всё шире используются для диагностики наследственных заболеваний, однако валидация результатов, показания к назначению, выбор метода и списка генов, схемы консультирования по результатам ещё требуют всестороннего обсуждения. Больные с сердечно-сосудистыми заболеваниями составляют значительную часть приёма врача-генетика, и зачастую обращаются как для первичного подтверждения диагноза, так и для интерпретации уже выполненных результатов исследования. Капиллярное секвенирование и полупроводниковое секвенирование с использованием набора праймеров AmpliSeq, как и все ПЦР-опосредованные методы, имеют сходные ограничения по качеству диагностики, в том числе, потерю гетерозиготности вследствие избирательной амплификации одного из аллелей при наличии полиморфизмов в 3’-области праймера. В докладе будут представлены результаты полученные при использовании таргетных панелей для поиска мутаций в генах, ответственных за наиболее частые варианты наследственных аритмий (11 генов, 30kb, 234 пары праймеров), дисплазий соединительной ткани (14 генов, 39kb, 342 пары праймеров), аритмогенной кардиомиопатии правого желудочка (16 генов, 94kb, 521 пара праймеров). Данная работа выполнена при секвенировании образцов ДНК для 160 больных на хотя бы одной панели.

Целью работы является анализ молекулярной основы нарушений формирования пола (НФП) 46,XY с использованием NGS. Проведено обследование 168 пациентов с НФП 46,XY. Секвенирование проводилось на секвенаторе PGM c использованием оригинальной таргетной панели Ion AmpliSeqTM для анализа 45 генов. У 1 пациента дополнительно проведено полноэкзомное секвенирование на секвенаторе Ion Proton. В результате у 92 пациентов обнаружены изменения нуклеотидной последовательности, классифицированные как патогенные, вероятно патогенные или варианты с неизвестной значимостью. Наиболее часто определялись мутации в генах AR (n=20), NR5A1 (n=14) и AMH (n=6). В группе с дефектами NR5A1 выявлено сочетание НФП 46,XY с надпочечниковой недостаточностью, обусловленное ранее неописанной мутацией G35D.

Диагностика моногенных заболеваний с помощью NGS за последние годы стала более эффективной. При этом для большинства случаев до сих пор не удаётся выявить причину патогенеза, и наоборот, находится много кандидатных вариантов из которых очень сложно определить реально патогенный. Мутации, приводящие к изменению сплайсинга, зачастую имеют очень чёткий патогенный эффект, при этом их не так просто идентифицировать. Связано это с тем, что в прохождении и регуляции сплайсинга участвует много белков, и они могут связываться со сплайсируемой РНК в любой её части: как в самих экзонах, так и глубоко в интронах. Программы, предсказывающие патогенность таких замен, работаю очень слабо. Поэтому, резюмируя выше сказанное, при анализе необходимо помнить о таких заменах и уделять им особенное внимание, а при нахождении проводить функциональный анализ таких мутаций для подтверждения их патогенности.

Популяризация геномных технологий, вызванная резким падением стоимости секвенирования ДНК, затронула в том числе область анализа каузативных мутаций, давая доступ к огромному количеству генетической информации. С другой стороны, работа медицинских генетиков затрудняется поиском среди всего множества естественных вариантов, выявляемых в геноме любого человека, патогенных. Классические молекулярно-биологические методы не обладают достаточной производительностью для проверки всех неописанных прежде вариантов, поэтому были разработаны специальные модели для in silico приоритиезации замен с последующей лабораторной валидацией. В последнее время, из-за аккумуляции достаточно больших массивов данных, стали разрабатываться модели, основанные на глубинном обучении (глубоких искусственных нейронных сетях), обещающие значительно повысить охват и точность предсказания. Нами были разработаны разработать собственные модели, использующие современные методы глубинного обучения, превосходящие по точности и покрытию доступные альтернативы. Для проведения анализа на патогенность находимых геномных вариантов нами был разработан бесплатный веб-сервис (http://score.generesearch.ru), с помощью которого любой желающий может провести анализ своих данных и быстро получить результат.

В докладе озвучена роль современной ДНК-диагностики на основе NGS анализа и выход к персонализированным подходам к лечению наследственных заболеваний.

Due to the rapidly increasing volume of biological data from sequencing, imaging, and other technologies, data processing needs in the Life Sciences are now on par with physical, mathematical, and engineering disciplines. Importantly, the distributed nature of data generation in biology makes this situation even more challenging. Today one can hardly find a research institution without multiple high-throughput sequencing machines, and we often hear about a "data crisis" in biology. National agencies, (such as NSF in the USA or CNRS in France) are investing heavily in cyberinfrastructure by supporting development of high performance computing (HPC) resources. Yet to a large extent these resources remain unknown to biological researchers who overwhelmingly continue to rely on fragile in-house computation. Simply advertising these systems to the biological community is unlikely to change this situation: Big Data is new to Life Sciences and most researchers do not possess the skills required for effective utilization of HPC systems. In this presentation I will demonstrate how this problem can be solved using Galaxy system developed in my group.

Мотивация и цели. Однонуклеотидные варианты (single-nucleotide variants, SNVs) — основной тип генетических вариантов, наблюдаемых в геномах разных индивидуумов. Большинство из них функционально-нейтральны, однако небольшая часть может стать причиной различных генетических заболеваний, включая рак. Задача данной работы — среди однонуклеотидных вариантов, ассоциированных с определенными заболеваниями и вносящих мутации в последовательность соответствующих белков (несинонимичных, nsSNVs) выделить те, которые могут существенно повлиять на структуру и функцию этих белков, и таким образом, являться причиной заболеваний. Был разработан алгоритм, реализованный в виде свободно доступного через интернет веб-сервиса StructMAn (http://structman.mpi-inf.mpg.de/). С его помощью мы показали, что около 50% мутаций, соответствующих частым и безвредным nsSNVs, лежат на поверхности белка и, вероятно, функционально нейтральны, тогда как более 75% мутаций, соответствующих nsSNVs, ассоциированным с различными заболеваниями лежат внутри белковой глобулы или на поверхности взаимодействия белка с другими молекулами. При этом варианты, ассоциированные с раком чаще лежат на поверхности взаимодействия с другими макромолекулами или в сайтах связывания лигандов, а варианты, ассоциированные с нераковыми заболеваниями чаще лежат внутри белка и, вероятно, дестабилизируют его структуру.

С появлением новых технологий в области генетики и геномики, в частности NGS, стало возможным быстрее, экономически эффективней, и многограннее исследовать возможные генетические дефекты. Однако проблема понимания взаимосвязей между генотипом и фенотипом стала гораздо более сложной при огромном навале генетической информации, получаемой с помощью NGS. Эта информация усложняет не только нашу способность понимать полигенные болезни, но и наше понимание моногенных признаков уже не совсем такое каким оно было раньше. Результаты многих клинических и научных исследований опровергли устоявшуюся догму 1 ген = 1 синдром и фенотипическая изменчивость некоторых заболеваний была продемонстрирована разнообразными наследственными механизмами. Чем больше генетической гетерогенности выявляется с помощью следующего поколения секвенирования тем более сложнее становится понять генотипные/фенотипные отношения. Огромное количество данных получаемых научными исследованиями и клиническим секвенированием немного устрашает, но при правильном подходе их использование может улучшить клинические исходы.

Африканские зеленые мартышки (верветки) широко используются в биомедицинских исследованиях для изучения строения мозга, поведения, метаболизма и иммунной системы приматов. Подобные исследования опираются на информацию о структуре и вариабельности генома. В докладе будут представлены результаты по получению референсного генома верветки и проведению полногеномного секвенирования 719 обезьян из исследовательского центра Vervet Research Colony. Для большинства обезьян из этой когорты доступна комплексная фенотипическая информация: продолжительность жизни, заболевания, информация о рождаемости и пр. Данный проект является на сегодняшний день наиболее полной попыткой охарактеризовать вариабельность генома приматов и показать, как полученные геномные данные транслируются в прикладные биомедицинские исследования.

Использование результатов секвенирования экзома в практической работе врача-генетика позволило существенно повысить эффективность медико-генетического консультирования, так как дало возможность проводить диагностику отдельных вариантов генетически гетерогенных групп заболеваний, сходных по клиническим проявлениям. Однако при трактовке результатов проведения секвенирования экзома врачом-генетиков возникает ряд проблем, которые требуют обсуждения. В докладе будет представлен анализ результатов секвенирования экзома 220 больных с эписиндромом.

Мотивация и цели. Наследственные болезни обмена веществ (НБО) - обширный класс моногенных заболеваний человека. Известно более 700 нозологических форм, каждая из которых встречается довольно редко в популяции. Многие из НБО имеют схожие клинические проявления, и без применения специальных лабораторных тестов дифференцировать их бывает сложно. Технологии секвенирования нового поколения прочно заняли лидирующее место в диагностике наследственных заболеваний человека, НБО не исключение. Несмотря на большой арсенал биохимических методов, которые возможно применять для диагностики НБО, молекулярно-генетические исследования для этих заболеваний иногда становятся определяющими в установлении диагноза. В рамках доклада будут обсуждаться несколько возможных сценариев диагностики НБО с применением NGS. Будут обсуждаться результаты анализа более 500 образцов на 5 разных таргетных панелях с оценкой эффективности данного метода диагностики; применение NGS в качестве метода подтверждения диагноза для НБО на примере органических ацидурий; и, конечно, уникальные и неожиданные находки, которые расширяют наше представление о клинических фенотипах НБО.

В докладе рассмотрены число и размер генов, приводящих к наследственным заболеваниям, скорость накопления этих данных, размеры и другие характеристики экзомных панелей различных производителей. Обсуждаются вопросы применимости данных, а также кастомных панелей для решения задач практической ДНК-диагностики. Оценивается востребованность панелей различного размера в зависимости от генетической гетерогенности заболевания. Кратко представлены собственные результаты.

Ген филамин C изначально был описан в связи с развитием миофибриллярной и дистальной миопатий, которые проявляются в возрасте 30-40 лет. Недавно мутации в гене FLNC были описаны в качестве причины развития различных типов кардиомиопатий. В частности, было показано, что мутации FLNC могут являются причинами развития рестриктивной кардиомиопатии (РКМП) – наиболее редкого и малоизученного типа кардиомиопатий. В связи с редкостью РКМП, а также недавним описанием данного гена в качестве причины патологии сердечно-сосудистой системы распространенность мутаций FLNC и клинические особенности течения филаминовых кардиомиопатий, в частности, среди детей с РКМП, неизвестна. В докладе будут представлены результаты исследования 17 детей с идиопатической РКМП; дети с врожденными нарушениями метаболизма и такими врожденными синдромами, как синдром Нунан не включались в исследование. Генотипирование проводилось с использованием панели для целевого обогащения HaloPlex при помощи прибора MiSeq (Illumina).

С 2011 года для скрининга анеуплоидий плода применяется неинвазивный тест, основанный на секвенировании внеклеточной ДНК в плазме крови беременной женщины, в которой помимо ДНК матери содержится 5-15% ДНК плода. Широкомасштабные клинические исследования показали высокую чувствительность и специфичность метода. В данной работе представлен опыт применения НИПС в рамках научно-исследовательской работы в НЦАГиП им. В.И. Кулакова и проиллюстрирован ряд биологических ограничений метода.